上海十一选五

IHC

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免疫组化常见问题原因分析

问题

可能原因

验证或解决办法

 

 

 

 

 

 

 

 

无染色

一抗和二抗不匹配

上海十一选五使用针对一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)

没有足够的一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度抗体。延长4℃孵育时间(如过夜)。

抗体的天然结构(3D形态)受损不适用于IHC

上海十一选五用天然(非变性的)WB法检测抗体,确保抗体没被损坏。

上海十一选五由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

上海十一选五做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

靶组织中没有目标蛋白

参照抗体供应商的建议做阳性对照。

上海十一选五组织中没有足够的目标蛋白

应用信号放大操作。

没有避光保存二抗

避免将二抗处于光照下

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间,更换二甲苯。

固定步骤(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)修饰了抗体识别表位

上海十一选五抗原修复法暴露出抗原表位,缩短固定时间。

上海十一选五蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜

在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

在抗体PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物,或使用新鲜无菌的PBS。

 

 

 

 

 

 

 

 

高背景

上海十一选五没有封闭非特异性结合或封闭不充分

延长封闭时间,并考虑改换封闭剂。建议用10%正常血清封闭切片1小时或1-5% BSA封闭培养细胞30分钟。

一抗浓度过高

滴定法寻找到最佳抗体浓度,或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最好是缓慢而准确地结合)。

孵育温度过高

4°C孵育切片或细胞。

二抗发生了非特异性结合(被损坏)

上海十一选五不加一抗,做二抗对照。

组织冲洗不彻底,有固定剂残留

上海十一选五所有步骤都要用PBS充分洗涤。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

固定过度(固定剂用福尔马林和多聚甲醛)导致抗体识别抗原位点被修饰

上海十一选五改变抗原修复方法,缩短与抗原修复液的孵育时间。

信号过度放大(信号放大技术)

缩短信号放大孵育时间,稀释信号扩大试剂盒。

染料与PBS在细胞/组织中相互作用(酶检测法)

用Tris缓冲液冲洗切片后,再与底物孵育。孵育后,Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。

通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

去除缓冲液中的通透剂

底物过量(酶检测法)

缩短底物孵育时间

 

 

 

非特异性染色

一抗/二抗浓度过高

降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。

上海十一选五存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织),加二抗后,二抗会与同源的所有组织结合

应用与组织非同源的一抗

切片/细胞变干

上海十一选五保持切片/细胞湿度,切勿变干。

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